黃曲霉毒素M1液相檢測操作規(guī)程

作為國內專業(yè)從事霉菌毒素檢測技術與產品服務的主要供應商之一， 近年來泰樂祺檢測應用實驗室重點關注食品安全事件尤其是涉及霉菌毒素安全等檢測技術問題，以期望快速提出解決方案。針對近期奶中出現的黃曲霉毒素M1超標問題，泰樂祺科技提出以下液相色譜法精準檢測方案。

1. 儀器

1.1 高效液相色譜儀配熒光檢測器

1.2 震蕩器（或高速攪拌器）

1.3 高速離心機

1.4 泵流操作架（帶氣泵）

2. 試劑與試液

2.1 色譜甲醇

2.2 蒸餾水

2.3 乙腈+水（25+75）

2.4 石油醚

2.5 10%乙腈

2.6 氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）

玻璃纖維濾紙（PriboFast免疫親和柱免費贈送）

3. 測定法

本法系用高效液相色譜法（GB/T 18980-2003）測定牛奶，奶粉等產品中的黃曲霉毒素M1，除另有規(guī)定外，按下列方法測定。

3.1 色譜條件

色譜柱：C18柱，150×4.6mm，5um

檢測器：熒光檢測器；激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長435nm；

流動相：乙腈-水（25：75）

流  速：1.0ml/min 

進樣量：20ul

柱  溫：室溫

3.2  標準品溶液的配制

取黃曲霉毒素M1標準品，用乙腈稀釋成0.5ug/ml的標準儲備液。根據使用需要，準確吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黃曲霉毒素標準儲備液，置5ml的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配成相當于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標準工作液，即得。

3.3  樣品前處理

3.3.1牛奶

將100mL牛奶水浴加熱至40℃；

4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用；

3.3.2乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品

稱取10g奶粉樣品，將100mL50℃水多次少量加入，攪拌，使奶粉充分溶解；

6000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用；

3.3.3發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)

稱取60 g混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調pH至7.4；

用高速均質器在 9500 轉/分鐘，高速勻漿5 min

水浴加熱至40℃；

4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

3.3.4干酪

稱取經切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50 mL離心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；

用高速均質器在 9500r/分鐘，高速勻漿5 min；

超聲提取30 min；

在6000r/分鐘下離心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振搖2 min；

待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。

重復用石油醚提取2次；。

將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL；

濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中；

加水稀釋至約50 mL，在6000 轉/分鐘下離心 5 min，上清液供凈化處理。

3.3.5奶油

稱取5g試樣，置于50 mL燒杯中；

用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。

加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中；

待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL，供凈化處理。

3.4  供試品溶液的制備

3.4.1 PriboFast® 黃曲霉毒素M1免疫親和柱的操作

將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準確移取50.0mL凈化溶液注入玻璃注射器；

將空氣壓力泵與注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3mL空氣通過柱體；

更換10ml注射器與親和柱連接，在注射器中加入10ml水，調節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。

準確加入4mL色譜級乙腈洗脫，流速為1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。（建議將乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要讓甲醇充分浸泡柱子里的凝膠2分鐘。洗脫后的乙腈溶液，水浴30℃加熱吹近干。用10%乙腈定容后上液相）

3.5 測定

精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標準工作液各20ul，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。另精密量取供試品溶液20ul，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素M1的量，計算，即得。

1.本實驗應有相應的安全、防護措施，并不得污染環(huán)境。

2.殘留有黃曲霉毒素M1的廢液或廢渣的玻璃器皿，應置于專用貯存容器（裝有10%氯酸鈉溶液）內，浸泡24小時以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。