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麥角生物堿 固相凈化柱柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

介紹:

麥角菌核是以麥角suan為基本結(jié)構(gòu)的一系列生物堿衍生物，如麥角新堿、麥角an、麥角克堿、麥角毒堿、麥角生堿、麥角辛、麥角隱亭、麥角考寧及它們的差向異構(gòu)體等。被麥角菌污染的谷物研磨加工成面粉后通常含有高濃度的麥角堿。攝食受污染的食品或飼料可能對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重影響。多量致病，少量治病，麥角堿亦可作為藥用，適用于子宮、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管。

背景:

在食品方面的研究領(lǐng)域中，對(duì)麥角生物堿的研究，常見(jiàn)的方法有:比色分析法(Colorimetry)，但此方法只適合總堿含量測(cè)定，不能區(qū)分麥角生物堿的差向異構(gòu)體;薄層色譜分析法(Thinlayerchromatography,TLC)分析方法簡(jiǎn)便、快速、成本低，但靈敏度低、重現(xiàn)性差，因此目前多用于定性分析及半定量分析;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，具有檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、儀器設(shè)備和樣品前處理簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，適用于大批量樣品篩查與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，然而也存在酶標(biāo)記抗體保存時(shí)間有限且用量大，交叉反應(yīng);氣相色譜法

( Gas Chromatography，GC)一般要求被分析物在一定溫度下易氣化且在氣化溫度下較穩(wěn)定。采用GC檢測(cè)肽型麥角生物堿時(shí)，肽型麥角生物堿在進(jìn)樣口溫度(250~300℃)下不穩(wěn)定、易分解，肽型麥角生物堿會(huì)發(fā)生熱分解，產(chǎn)生縮氨酸部分。利用質(zhì)譜法(Mass spectrometer,MS)可以區(qū)分肽型麥角生物堿和其他麥角生物堿，但對(duì)于肽型麥角生物堿的差向異構(gòu)體，如:麥角an和麥角an寧，則不能進(jìn)行區(qū)分;高效液相色譜分析法(Highperformance liquid chromatography,HPLC),該方法具有分析效率高、重現(xiàn)性好、專一性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的一種麥角生物堿的檢測(cè)方法，該方法不宜鑒定新化合物、區(qū)分特征麥角生物堿及其異構(gòu)體;綜合來(lái)說(shuō)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)應(yīng)用廣泛，這種方法能定量分析麥角生物堿的同時(shí)確定麥角生物堿的相對(duì)分子質(zhì)量，還可能得到新的化合物。本方案參考 GB 2715-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)糧食》采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。

1.儀器設(shè)備

1.1.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀

1.2.離心機(jī):轉(zhuǎn)速能達(dá)到10000r/min。

1.3.超聲波/斡旋混合或搖床。廠家:Pribolab 型號(hào):DMT-2500

1.4.分析天平:0.01g。

1.5.泵流操作架。廠家:Pribolab

1.6.固相凈化柱。廠家:Pribolab

2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1. 提取與分離純化

提取粉碎樣品后，稱取4g于50mL離心管中，加入20mL 乙腈-碳酸銨混合溶液(84/16,v/v),振蕩提取30 min,4℃,10000r/min，離心10 min,上清液過(guò)濾，待純化。純化取4mL濾液加入試管中，將試管緩慢推入Pribolab®MFC333麥角生物堿固相凈化柱，直至試管底部，量取凈化柱管內(nèi)洗脫液 0.5 mL于另一試管中，再加入0.5mL碳酸銨溶液(3 mmol/L)，混合均勻，通過(guò)微孔濾膜(0.2 μm)過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶，待上機(jī)分析測(cè)定。

2.2.測(cè)定

2.2.1.液相色譜條件

色譜柱:Gemini-NX 3u C18 ( 100 mm x2.0 mm) (i.d. )，3 μm )

液相色譜柱或相當(dāng)者。

流動(dòng)相:A-乙腈，B-碳酸銨溶液(3 mmol/L)。

柱溫:30℃。

流速:0.3 mL/min.

進(jìn)樣量:5 μL.

梯度洗脫條件見(jiàn)表1.

2.2.2.質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧電離(ESI)。

掃描方式:正離子掃描。

電噴霧電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助氣、氣簾氣和碰撞氣均為高純氮?dú)猓褂们皯?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求。

監(jiān)測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

結(jié)論:

本文以乙腈-碳酸銨混合溶液(84/16，v/v)提取樣品，Pribolab 固相凈化柱凈化，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分離檢測(cè)后，可同時(shí)測(cè)定小麥中多種麥角生物堿。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)檢測(cè)條件、樣品前處理過(guò)程及固相凈化手段的優(yōu)化，使得該方法應(yīng)用于小麥基質(zhì)中均能得到較好的回收效果及重現(xiàn)性。本方法操作簡(jiǎn)單、可行性強(qiáng)、回收率高、結(jié)果準(zhǔn)確、檢出限低，方法學(xué)各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均滿足定性、定量分析要求，適用于小麥中麥角生物堿的測(cè)定。